紙層析法。色素在濾紙條上能分離的原因是四種色素隨著層析液在濾紙上的擴(kuò)散速度不同。四條色素帶從上到下依次為胡蘿卜素、葉黃素、葉綠素a，葉綠素b。

紙層析法原理

紙層析法依據(jù)極性相似相溶原理，是以濾紙纖維的結(jié)合水為固定相，而以有機(jī)溶劑作為流動相。由于樣品中各物質(zhì)分配系數(shù)不同，因而擴(kuò)散速度不同，從而達(dá)到分離的目的。

試樣經(jīng)層析后可用比移值（Rf）表示各組成成分的位置（比移值=原點中心至色譜斑點中心的距離與原點中心至流動相前沿的距離之比），由于影響比移值的因素較多，因此一般采用在相同實驗條件下對照物質(zhì)對比以確定其異同。

作為單體鑒別時，試樣所顯主色譜斑點的顏色（或熒光）與供置，應(yīng)與對照（標(biāo)準(zhǔn)）樣所顯主色的譜斑點或供試品-對照品（1∶1）混合所顯的主色譜斑點相同。作為質(zhì)量指標(biāo)（純度）檢查時，可取一定量的試樣，經(jīng)展開后，按各單體的規(guī)定，檢視其所顯雜質(zhì)色譜斑點的個數(shù)或呈色（或熒光）的強(qiáng)度。作為含量測定時，可將色譜斑點剪下洗脫后，再用適宜的方法測定，也可用色譜掃描儀測定。

葉綠體色素理化性質(zhì)

這二大類四種色素都不溶于水，而溶于有機(jī)溶劑，如乙醇、丙酮等。通常用80%的丙酮或丙酮：乙醇：水為4.5：4.5：1的混合液來提取葉綠素。

按化學(xué)性質(zhì)來說，葉綠素是葉綠酸的酯，在堿的作用下，可使其酯鍵發(fā)生皂化作用，生成葉綠酸的鹽，能溶于水，但由于它保留有Mg核的結(jié)構(gòu)，仍保持原來的綠色。而類胡蘿卜素中，胡蘿卜素是不飽和的碳?xì)浠�合物，β―胡蘿卜素水解可生成2分子維生素A，葉黃素是由胡蘿卜素衍生的二元醇，不能與堿發(fā)生皂化反應(yīng)，根據(jù)這一點，可以將葉綠素和類胡蘿卜素分開。

此外，葉綠素還可以在酸的作用下，其中的Mg被H所代替形成褐色的去Mg葉綠素：去Mg葉綠素能與其他金屬鹽中的銅、鋅、鐵鹽等代H，又重新呈現(xiàn)綠色，比原來的綠色更穩(wěn)定。根據(jù)這一原理可用醋酸銅處理來保存綠色標(biāo)本。